Створення бібліотеки кДНК починається з мРНК замість ДНК. Месенджер РНК переносить закодовану інформацію від ДНК до рибосом для трансляції в білок. Щоб створити бібліотеку кДНК, ці молекули мРНК обробляють ферментом зворотної транскриптази, який використовується для створення копії ДНК мРНК. (тобто кДНК).
Ампліфіковану РНК очищають за допомогою спінової колонки, а потім здійснюють зворотну транскрипцію за допомогою випадкових праймерів у кДНК. Ми позначаємо кДНК, отриману за допомогою реакції набору MessageBOOSTER, як «кДНК MessageBOOSTER». Для контрольних реакцій ми синтезували кДНК безпосередньо з клітинних лізатів без етапу ампліфікації РНК.
Перетворення мРНК у дволанцюгову кДНК для вставки у вектор здійснюється двома частинами. по-перше, інтактна мРНК, гібридизована з оліго(dT) праймером, копіюється зворотною транскриптазою, а продукти виділяються екстракцією фенолом і осадженням етанолом.
дотримуючись протоколу для синтезу кДНК, вам потрібно буде розведіть мРНК до 5 нг/мкл (1 об’єм РНК при 22 нг/мкл з 3,4 об’єму води дасть вам 4,4 об’єму РНК при 5 нг/мкл), а потім використовуйте 4 мкл вашого розведеного зразка в реакційній суміші (яка фіксується на 20 мкл). ). ps: 1vol = 1 том, що завгодно.
протокол синтезу кДНК
- Крок 1 Підготуйте. зразок.
- Крок 2 Видаліть. геномна ДНК.
- Крок 3 Виберіть реверс. транскриптаза.
- Крок 4 Підготуйте. реакційна суміш.
- Крок 5 Виконайте. синтез кДНК.